Cellule staminali neuronali e microglia: cross-talk in neuroinflammatione

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RebloggedCELLULE STAMINALI NEURONALI E MICROGLIA- CROSS-TALK IN UN MODELLO IN VITRO DI NEUROINFIAMMAZIONE

La neuroinfiammazione

La neuroinfiammazione è un processo mediato da citochine spesso associato ad un danno diretto del sistema nervoso centrale o periferico. Lo scopo primario del processo neuroinfiammatorio consiste nell’attivare meccanismi atti a proteggere i neuroni sopravvissuti all’insulto; tuttavia se l’entità del fenomeno infiammatorio supera una certa soglia, può produrre effetti negativi e addirittura esacerbare il danno neuronale.

Gli elementi cellulari maggiormente coinvolti nella neuroinfiammazione sono gli astrociti e le cellule della microglia; queste ultime, attivate da diversi mediatori cerebrali, producono numerose molecole pro-infiammatorie, anti-infiammatorie e immunomodulatorie atte a sostenere e ad amplificare il processo infiammatorio stesso. Poiché un’attivazione microgliale prolungata e incontrollata risulta deleteria per i neuroni l’inibizione dello stato neuroinfiammatorio costituisce oggi un target d’elezione nella ricerca di strategie atte a limitare il danno neuronale.

neuroinflammazione e lesione neuronale

In caso di lesione neuronale vengono rilasciate ingenti quantità di mediatori tra i quali l’ATP che, tramite l’interazione son specifici recettori purinergici svolge un ruolo di primo piano attivando le cellule microgliali. In questi ultimi anni, allo scopo di contrastare la degenerazione neuronale che caratterizza diverse patologie, numerosi studi sono stati condotti alla definizione di una strategia terapeutica basata sul trapianto di cellule staminali neuronali (NSC). Il razionale del loro impiego trae origine dalla loro presunta capacità di proliferare e differenziare in cellule neuronali all’interno del parenchima cerebrale; in tal modo, esse potrebbero sostituire i neuroni e i circuiti neuronali danneggiati.

Tuttavia, le più recenti evidenze sperimentali dimostrano che gli effetti positivi esercitati dalle NSC sulla lesione neuronale in modelli animali di patologie neurodegenerative non sono frutto unicamente del processo di differenziamento in cellule neuronali, bensì il risultato di modificazioni dell’ambiente extracellulare dell’area colpita ad opera delle cellule staminali stesse (Capone, Frigerio et al. 2007).

Neuroinflammazione e microglia; TNF-α e di COX-2

Diversi studi attestano infatti la presenza di interazioni tra cellule della microglia e le NSC: in modelli murini di ischemia cerebrale il trapianto di NSC determina una significativa proliferazione della microglia nell’area della lesione (Capone, Frigerio et al. 2007). Alla luce di tali evidenze sperimentali, la nostra ricerca si è proposta di studiare le possibili interazioni tra cellule microgliali attivate e NSC, utilizzando un modello in vitro costituito da cellule N9, una linea immortalizzata di microglia murina, stimolata con ATP e coltivata in presenza di terreni condizionati da NSC.

I risultati ottenuti dimostrano che la pre-incubazione delle cellule di microglia N9 nei terreni condizionati da NSC conferisce loro una minore suscettibilità allo stimolo pro-infiammatorio dell’ATP. Tale effetto è risultato evidente su diversi aspetti funzionali delle cellule N9, quali la mobilizzazione del calcio intracellulare, indice di attivazione cellulare, la modificazione dell’espressione genica di molecole pro-infiammatorie, come TNF-α e COX-2 e, infine, la proliferazione cellulare. Infatti, l’incubazione delle cellule N9 nei terreni condizionati da NSC è in grado di diminuire significativamente la liberazione del calcio intracellulare stimolata dall’ATP, suggerendo che i terreni condizionati dalle NSC contengano dei fattori solubili in grado di contrastare l’azione diretta dell’ATP sui recettori purinergici. Al momento tali fattori non sono noti.

Tra i recettori purinergici, il sottotipo P2X7 sembrerebbe svolgere un ruolo critico nella modulazione del processo neuroinfiammatorio sostenuto dalla microglia; infatti, l’inibizione di tale recettore nella microglia attivata sembrerebbe ridurre la risposta infiammatoria sia in vivo che in vitro ed esercitare un effetto neuroprotettivo in vivo (Choi, Hong et al. 2003). Ulteriori studi saranno necessari per individuare quale, tra i fattori rilasciati dalle NSC, sia in grado di interferire con l’attivazione microgliale mediata dal recettore P2X7.

Segnaliazioni della letteratura evidenziano che l’attivazione del TNF-α avviene nelle prime fasi dell’ischemia cerebrale. Tale citochina promuove l’avvio delle fasi precoci del processo infiammatorio, incrementando l’espressione di fattori chemiotattici e di molecole di adesione da parte dell’endotelio vascolare, che, a loro volta, favoriscono l’infiltrazione di cellule del sistema immunitario nel sito della lesione (Wang, Tang et al. 2007). Tuttavia, è stato dimostrato che la modulazione dell’attività del TNF-α nelle fasi precoci dell’ischemia riduce il danno neuronale, e migliora l’outcome neurologico in modelli animali di patologia ischemica (Hosomi, Ban et al. 2005).

In accordo con i dati della letteratura, i risultati da noi ottenuti dimostrano che, nel nostro modello in vitro, la stimolazione delle cellule N9 con ATP induce un aumento dell’espressione di mRNA per TNF-α, mimando in parte ciò che accade in vivo. L’incubazione delle cellule N9 con i terreni condizionati da NSC è in grado di ridurre l’espressione di TNF-α e di COX-2, confermando che le NSC sarebbero capaci di modulare la risposta pro-infiammatoria nelle cellule N9 attraverso il rilascio di fattori solubili. A sostegno di questa ipotesi, dati recenti presenti in letteratura riportano che le NSC iniettate in modelli murini di ischemia cerebrale emorragica riducono il danno neurologico, esibendo proprietà anti-apoptotiche e anti-infiammatorie (Lee, Chu et al. 2008).

Oltre all’incremento di TNF-α e di COX-2 osservato nelle cellule N9 stimolate con ATP, i nostri risultati dimostrano anche un aumento dell’espressione di IL-10, una citochina dotata di attività anti-infiammatoria. Poichè la IL-10 risulta stimolata in concomitanza con altre molecole pro-infiammatorie, potrebbe rappresentare un fattore della risposta immediata delle cellule N9, finalisticamente volta allo spegnimento del segnale infiammatorio.

Gli esperimenti condotti per valutare la vitalità cellulare delle cellule N9 stimolate con ATP ed esposte ai terreni condizionati dalle NSC avvalorano l’ipotesi che le NSC siano in grado di interagire con le cellule microgliali, riducendo da una parte l’attivazione mediata dall’interazione tra l’ATP e i recettori purinergici, ed esercitando dall’altra un effetto anti- infiammatorio e protettivo nei confronti della morte cellulare.

Tale azione protettiva riveste un’importanza cruciale in riferimento alla popolazione neuronale che subisce il danno primario in seguito all’evento ischemico. L’osservazione che fattori solubili prodotti dalle cellule staminali neuronali siano protettivi, in modo specifico verso l’effetto tossico di ATP, anche verso la linea neuronale Neuro2A dimostra che l’azione delle NSC nel cervello non è da ricercarsi unicamente nella produzione di fattori trofici o nel replacement cellulare, ma anche nella produzione di fattori che prevengono la suscettibilità all’insulto da ATP.

Il fatto che il prolungamento da un’ora a tre ore dell’esposizione delle cellule N9 ai terreni condizionati da NSC negli esperimenti per la valutazione del rilascio di calcio, e da tre a ventiquattro ore in quelli per la misurazione della vitalità cellulare, si sia rivelato maggiormente efficace nell’attenuare la risposta delle cellule N9 allo stimolo pro- infiammatorio fa inoltre supporre che l’azione dei fattori solubili rilasciati dalle NSC sulle cellule N9 sia di tipo lento, e che probabilmente sia mediato, a sua volta, da altri meccanismi al momento non noti.

Tra le proprietà delle cellule microgliali è stata ampiamente descritta in letteratura la loro capacità di attrarre la migrazione delle cellule staminali nel sito della lesione mediante la produzione di sostanze con attività chemio tattica successivamente ad un danno cerebrale localizzato (Aarum, Sandberg et al. 2003; Lepore, Han et al. 2004). I nostri risultati dimostrano che la stimolazione delle cellule N9 con ATP induce un aumento dell’espressione di molecole chemiotattiche quali MIP-1, MCP-1, IP-10 e PDGF-b, descritto come descritto anche da altri autori sia in vivo che in vitro (Belmadani, Tran et al. 2006; Rebenko-Moll, Liu et al. 2006; Kataoka, Tozaki-Saitoh et al. 2009).

E’ noto che MCP-1 è sintetizzato in vivo nel corso del processo neuroinfiammatorio ed è importante per la migrazione dei leucociti nel SNC; questo fenomeno si è riscontrato anche per le cellule staminali trapiantate nel cervello. Alcuni dati interessanti dimostrano che l’entità del fenomeno migratorio risulta significativamente ridotta nel caso in cui le NSC siano prodotte a partire da topi knock-out per il recettore di MCP-1(CCR2) (Belmadani, Tran et al. 2006). In un elegante esperimento condotto in un modello ex-vivo, le NSC ottenute da topi KO per CCR2 sono state trapiantate su fettine organotipiche di ippocampo (prelevate da topi wild-type dello stesso ceppo), e la loro migrazione cellulare è risultata significativamente ridotta rispetto alle NSC ottenute da topi wt. Questo risultato indica il coinvolgimento diretto di MCP-1 nella migrazione dei progenitori in condizioni di neuroinfiammazione (Belmadani, Tran et al. 2006). Il ruolo di MCP-1, insieme ad altri fattori chemiotattici, come SDF-1, è stato dimostrato nell’induzione di trasmigrazione anche da parte degli astrociti in un modello in vitro di ipossia (Xu, Wang et al. 2007).

Neuroinflammazione e modello di trasmigrazione in vitro

Nel nostro modello di trasmigrazione in vitro abbiamo confermato che le cellule microgliali sono in grado di indurre un aumento della trasmigrazione spontanea nelle NSC in seguito a stimolazione con ATP. Il silenziamento genico di MCP-1 nelle cellule microgliali mediante RNA interference ha determinato l’inibizione dell’effetto pro-migratorio delle cellule microgliali N9 stimolate con ATP. Questi risultati dimostrano il ruolo cruciale di MCP-1 nel richiamo di cellule staminali da parte della microglia.

L’osservazione che i fattori solubili rilasciati dalle cellule staminali siano in grado di interferire nella stimolazione da ATP di altri tipi cellulari ci ha fatto interrogare su altre possibili patologie nelle quali l’ATP svolge un possibile ruolo eziopatogenico. Tra queste, il dolore neuropatico è una patologia che desta oggi particolare interesse. Abbiamo voluto indagare se i fattori solubili prodotti dalle cellule staminali embrionali possono avere un effetto protettivo anche in un modello murino di sviluppo del dolore neuropatico. In particolare, ci siamo interessati ai fenomeni di attivazione delle cellule di Schwann, che sono coinvolte già nelle primissime fasi del danno ai nervi periferici. Esse sono esposte all’ATP liberato in seguito alla lesione e sono in grado di produrre fattori pro-infiammatori scatenanti della risposta immunitaria. Per questi esperimenti abbiamo utilizzato una linea di cellule di Schwann immortalizzate, le IMS32, che mantengono moltissime caratteristiche delle cellule di Schwann primarie.

Abbiamo analizzato la responsività delle cellule IMS32 allo stimolo con ATP in termini di mobilizzazione del Ca2+ citoplasmatico. Anche in questo caso i terreni condizionati dalle NSC a diversi passaggi si sono rivelati efficaci nel diminuire significativamente l’aumento di Ca2+ indotto da ATP nelle cellule IMS32. E’ da notare che l’entità di questo effetto è stata minore nelle IMS32 rispetto a quanto osservato nelle cellule microgliali N9. Studi successivi saranno necessari per chiarire quali possano essere le differenze a livello di signaling intracellulare che possano giustificare queste differenze.

In conclusione i dati ottenuti in questa ricerca dimostrano che le cellule N9 costituiscono un buon modello sperimentale per lo studio delle interazioni tra NSC e cellule gliali in condizioni di neuroinfiammazione.

Questa ricerca dimostra che le cellule staminali neuronali sono in grado di modulare positivamente la suscettibilità delle cellule N9 al trattamento con ATP, confermando l’ipotesi di un cross-talk tra i due tipi cellulari, e questa modulazione è dipendente da fattori solubili rilasciati dalle cellule nel terreno di coltura durante la loro normale crescita.

La suscettibilità all’ATP viene modulata sia dal punto di vista dell’attivazione in senso pro- infiammatorio, sia dal punto di vista dell’effetto tossico che alte concentrazioni di ATP extracellulare esercitano sulle cellule di microglia e cui neuroni. Le cellule gliali sono in grado di richiamare nel sito di lesione le cellule staminali neuronali. Nella nostra ricerca abbiamo dimostrato che MCP-1 è una chemochina prodotta in seguito a stimolazione con ATP e ha un ruolo cruciale nel fenomeno di richiamo delle NSC.

In futuro sarà indagato il ruolo anche di altre molecole ad azione chemoattrattrice per chiarire i meccanismi alla base del movimento delle NSC nel cervello. Questi studi saranno preziosi per l’applicazione nella terapia basata sul trapianto di cellule staminali nel cervello, sia nel trattamento dell’ischemia cerebrale che nel trattamento di altre malattie degenerative a carattere infiammatorio.

I dati ottenuti sulle cellule di Schwann e nella linea neuronale Neuro2A dimostrano che gli effetti mediati dalle NSC non sono specifici per le cellule di microglia. In futuro questi dati necessiteranno di essere ulteriormente approfonditi per verificare in ruolo delle cellule staminali neuronali, e dei fattori da esse prodotti, nella suscettibilità all’ATP delle popolazioni cellulare cerebrali.

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