CANNABINOIDI E PATOLOGIE INTESTINALI

REBLOGGED

CANNABINOIDI E PATOLOGIE INTESTINALI
Tutor: Coordinatore:
Ch.mo Prof. Ch.mo Prof.
Nicola Mascolo Enrico Abignente

Candidato:
Dott. Raffaele Capasso

CANNABINOIDI E PATOLOGIE INTESTINALI

2
RINGRAZIAMENTI
Desidero innanzitutto ringraziare il mio tutor, Prof. Nicola Mascolo, per la
preziosa e costante supervisione.
Un particolare ringraziamento al Prof. Angelo Izzo, che mi ha sostenuto e
seguito con attenzione dandomi sempre preziosi consigli durante tutto il
mio lavoro di ricerca.
Ringrazio inoltre la Dott.ssa Francesca Borrelli che mi ha sempre
incoraggiato nella mia ricerca.
Un ringraziamento affettuoso alla Dott.ssa Valeria Ascione ed alla Dott.ssa
Gabriella Aviello, preziose compagne di lavoro, nonché alle studentesse
interne Adriana Iovino, Marta Compagnone e Barbara Romano, valide
collaboratrici nel corso del mio dottorato di ricerca.
Infine, ringrazio il coordinatore del dottorato di ricerca, Prof. Enrico
Abignente, per la cortese disponibilità che ha sempre avuto nei miei
confronti. 3
INDICE
1.0 INTRODUZIONE pag. 4
2.0 BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA ED OBIETTIVO DELLA
RICERCA pag. 24
3.0 MATERIALI E METODI pag. 26
3.0.1 Animali
3.0.2 Accumulo di fluido intestinale indotto dalla tossina colerica pag. 26
3.0.3 Transito intestinale nel tenue pag. 28
3.0.4 Colite ulcerosa in pazienti pag. 30
3.0.5 Western blot pag. 30
3.0.6 Dosaggio degli endocannabinoidi pag. 31
3.0.7 Attività dell’enzima anandamide amidoidrolasi pag. 32
3.0.8 Immunoistochimica pag. 32
3.0.9 Analisi RT-PCR semi-quantitativa pag. 35
3.1.0 Farmaci utilizzati pag. 36
3.1.1 Analisi statistica pag. 38
4.0 RISULTATI pag. 39
4.1 Accumulo di fluido indotto dalla tossina colerica pag. 39
4.2 Valutazione dei livelli degli endocannabinoidi e dell’attività
dell’anandamide amidoidrolasi pag. 43
4.3 Immunoistochimica pag. 46
4.4 Studio dell’espressione dell’mRNA dei recettori CB1
mediante RT-PCR semiquantitativa pag. 49
4.5 Effetto degli agonisti dei recettori dei cannabinoidi sul transito
intestinale durante un processo infiammatorio pag. 51
4.6 Effetto della palmitoiletanolamide nel controllo della motilità
intestinale in animali in condizioni fisiopatologiche pag. 55
4.7 Livelli dell’anandamide e della palmitoiletanolamide in
pazienti affetti da colite ulcerosa pag. 64
5.0 DISCUSSIONE pag. 67
6.0 CONCLUSIONI pag. 76
7.0 BIBLIOGRAFIA pag. 78

4
1.0 INTRODUZIONE
La canape indiana è costituita dalle infiorescenze femminili disseccate di
una varietà fisiologica di Cannabis sativa L.var.indica (canape indiana
propriamente detta). Cannabis deriva dal greco kαnαβoi e significa acqua
stagnante; infatti la pianta si sviluppa meglio in luoghi umidi.
E’ una pianta erbacea annuale (Figura 1), che può raggiungere anche i 2-4
metri d’altezza. Originaria dell’Asia centrale e occidentale, cresce in
numerose regioni tropicali e temperate dove è utilizzata per la produzione
di fibre e semi. Le fibre del caule sono lunghe e resistenti e sono adoperate
per la produzione di corde e tappeti. I semi contengono un olio fisso che è
usato a scopo industriale. Il caule, del diametro di circa 10 cm, è eretto,
semplice o ramificato ed è ricoperto di brevi peli. Le foglie sono peziolate,
ruvide e stipolate; quelle inferiori appaiono palmate, composte e lanceolate
mentre quelle superiori sono alterne, decrescenti fino a ridursi a tre
segmenti, talora ad uno solo.
La specie è dioica, con fiori maschili e femminili in piante separate. Sia la
specie dioica che monoica produce principi attivi, ma è preferita la prima
perchè fornisce una resina con alta concentrazione di sostanze psicoattive.
Le foglie di entrambi i tipi di piante presentano peli protettori con apice
appuntito e base slargata, contenente un cistolito di carbonato di calcio. Le
foglie e le brattee hanno anche peli ghiandolari, con peduncolo pluriseriato
e una capocchia che presenta cellule disposte a raggiera, che secernono una 5
Figura 1. Cannabis sativa6
resina ricca di principi attivi. Sia i fiori maschili che quelli femminili sono
ascellari: ramificati e penduli i primi, eretti e più piccoli i secondi. Il frutto
è un achenio uniloculare, ovale, lungo 5 mm., largo 2 mm.
La Cannabis coltivata ab antico è stata usata per millenni come pianta
tessile e come fonte di medicamenti. Si suppone, infatti, che il suo uso
risalga all’età neolitica nei territori situati a sud-ovest del Mar Caspio e
corrispondenti all’attuale Afganistan. La canape era conosciuta anche dai
cinesi che sono stati i primi a descriverne le proprietà medicinali e dagli
indiani che preparavano un infuso chiamato bhang assunto durante
particolari riti religiosi. Gli Assiri bruciavano nei loro templi una sostanza
chiamata qunnabu, mentre Caldei e Persiani la conoscevano
rispettivamente con il nome di kanbun e kenab. Nel mondo islamico la
canape indiana era tenuta in grandissima considerazione: hashish in arabo
significa erba anzi l’erba per eccellenza.
In Europa l’uso voluttuario della canape fu introdotto nell’800 in seguito
alla conquista dei territori dell’impero ottomano da parte delle truppe
napoleoniche. La canape fu oggetto di attenzione anche da parte dei medici
europei, infatti, William O’Shaughnessy nel 1842 la introdusse per curare
diverse patologie (dolore, spasmi muscolari, convulsioni, reumatismi,
epilessia), entrando così a far parte della medicina occidentale e
successivamente di quella americana. Durante il periodo in cui fu utilizzata
nella medicina occidentale, la canape ebbe applicazioni anche nel campo 7
dei disturbi gastrointestinali: dolori addominali, gastroenteriti e diarrea. A
questi usi possono essere associati anche i racconti aneddotici che indicano
l’uso di preparazioni a base di canape per alleviare i sintomi del morbo di
Crohn e della gastroparesi diabetica.
Tuttavia con il passare del tempo si cominciò a scoraggiarne l’uso ed i
motivi principali di questo declino furono molteplici e complessi. Rimane
traccia nei testi dell’epoca di un’imprevedibilità dell’azione degli estratti
dovuta all’estrema variabilità della loro potenza, dell’impossibilità di
ottimizzarne il dosaggio e della presenza degli effetti collaterali dovuti
all’azione sul sistema nervoso centrale.
Con l’avvento dei farmaci di sintesi (anestetici, aspirina, barbiturici e
benzodiazepine, fenotiazine) le preparazioni di canape andarono
rapidamente in disuso e vennero cancellate dalla Farmacopea Britannica
(1932), da quella americana (1942) e da quella italiana (nell’edizione
successiva al 1940) e la sua notorietà si legò all’uso illegale.
Nella seconda metà del XX secolo con l’isolamento e l’identificazione dei
cannabinoidi si è rinnovato l’interesse della comunità scientifica nei
confronti della canape. Più di 70 cannabinoidi sono stati identificati e tra
questi il più abbondante è il ∆9
-tetraidrocannabinolo (∆9
-THC), ritenuto il
principale ma non il solo responsabile dei suoi effetti farmacologici. Altri
costituenti sono il cannabinolo, il cannabidiolo, il cannabigerolo, il
cannabicromene ed i relativi acidi. 8
Le principali preparazioni si ottengono utilizzando le infiorescenze
femminili della canape indiana, raccolte poco prima della fioritura
(generalmente in aprile) quando le foglie incominciano ad ingiallire. Tra
queste ricordiamo:
– ganja o genjha costituita dagli steli lunghi circa un metro, privati
delle foglie e disposti in pacchi recanti all’estremità le infiorescenze
femminili. Tra tutte è la più pregiata e ricca di resine;
– marihuana o manancha costituita unicamente dalle infiorescenze
femminili disseccate;
– hashish o bhang o kif o charas, costituita dall’essudato resinoso che
si ricava dalle sommità fiorite, sia femminili che maschili e dalle
foglie. Anche se meno pregiata quest’ultima è la qualità più comune
nei mercati europei.
Gli effetti farmacologici della canape variano in dipendenza della dose,
della via di somministrazione, della vulnerabilità agli effetti psicoattivi e
delle condizioni di utilizzo.
Il più comune ed apparentemente più efficace metodo per somministrare la
canape è il fumo: circa il 20 % del ∆9
-THC contenuto in una sigaretta di
cannabis viene assorbito. Gli effetti compaiono rapidamente e persistono
per circa due ore. La via parenterale, praticamente non usata, ha tempi
ancora più brevi. La sua somministrazione orale è meno efficace e la
biodisponibilità è molto variabile rispetto a quando la droga viene fumata 9
(Mechoulam, 1996). Gli effetti ottenuti con la cannabis variano
notevolmente in relazione al contenuto in principi attivi della preparazione
usata, alle modalità di assunzione, alla velocità con cui è metabolizzata,
alla durata ed all’intensità dell’abuso. Altri fattori importanti sono
rappresentati dalla personalità del soggetto, dal suo stato d’animo, dalle
aspettative, da precedenti esperienze e dalle condizioni ambientali.
L’intossicazione da canape indiana produce cambiamenti nell’umore, nelle
percezioni e nelle motivazioni. Si instaura uno stato onirico con ideazione
sconnessa ed incontrollabile, alterazione della percezione spazio-tempo,
allucinazioni visive ed un senso psichico e fisico di benessere. Il tono
dell’umore è esaltato, sono assai frequenti scoppi di ilarità immotivata.
Durante lo stato di euforia vi è compromissione delle funzioni cognitive e
percettive, del tempo di reazione, dell’apprendimento e della memoria con
complessi cambiamenti comportamentali quali incostanza e aumentato
desiderio di cibo. Sebbene alcuni fumatori riferiscano, un stato di euforia,
un aumento della libido e un maggior senso di consapevolezza di sé, questi
effetti non sono stati confermati. Si possono verificare anche reazioni
spiacevoli quali: panico, psicosi acuta e sdoppiamento della personalità.
Non sono riportati finora casi di intossicazione mortale né la comparsa di
grave dipendenza fisica ma solo casi di tolleranza e di tossicomania. La
dipendenza fisica è stata comunque documentata nell’animale di
laboratorio. 10
Il meccanismo d’azione del ∆9
-THC è stato per anni ignoto. Non più di 20
anni fa si ritenenva che, il ∆9
-THC, essendo una sostanza molto lipofila
agisse per un’interazione aspecifica con le membrane cellulari. Nel 1988 si
è dimostrata l’esistenza di specifici recettori per i cannabinoidi. Il recettore
CB1 è stato infatti identificato da Devane e collaboratori (1988) e
successivamente clonato nel 1990 (Matsuda e coll.), mentre il recettore CB2
è stato clonato nel 1993 (Munro e coll.). Entrambi i recettori appaiono
accoppiati a proteine Gi/o e determinano inibizione dell’adenilato ciclasi e
dei canali del Ca2+ di tipo N o P/Q (Figura 2) ed attivazione dei canali del
K+
(Di Marzo e coll., 2000; Izzo e coll., 2001a).
I recettori CB1 sono localizzati sia nel sistema nervoso centrale (dove sono
responsabili dei caratteristici effetti dei cannabinoidi in particolare quelli
sulla cognizione e sulla memoria, l’analgesia e la depressione dell’attività
motoria) che in diversi organi periferici (cuore, occhio, deferente, intestino,
vescica). Nel sistema nervoso periferico i recettori CB1 sono localizzati
presinapticamente o pregiunzionalmente e la loro attivazione è messa in
relazione con gli effetti dei cannabinoidi quali stimolazione dell’appetito,
vasodilatazione (particolarmente evidenti a livello dei vasi congiuntivali),
tachicardia, ritenzione urinaria ed inibizione della motilità intestinale
(Pertwee, 1999). 11
Figura 2. Vie di trasduzione del segnale attivate dagli agonisti dei
cannabinoidi
Blocco dei canali
del calcio
α
β
γ
A
[Ca2+]
Ca2+ K+
Attivazione dei
canali del potassio
[K+
]
[cAMP]
A
[cAMP]
β
CB γ 1 CB2
β
Attivazione della cascata
dell’ERK
Agonisti dei cannabinoidi
(-) (+)
Attivazione della cascata
ell’ERK
(-) (-)
extracellulare
intracellulare Gi/o Gi/o12
Per i recettori CB2 l’unica localizzazione nota è a livello periferico ed in
particolare essi sembrano essere espressi principalmente sulle cellule del
sistema immunitario (Mechoulam e coll., 1998).
Come per la morfina la scoperta dei recettori per i cannabinoidi di origine
vegetale ha fatto ipotizzare la presenza di cannabinoidi endogeni in grado
di legarsi a questi recettori. Infatti l’arachidoniletanolamide detta anche
anandamide (dal termine sanscrito ananda che vuol dire felicità perfetta) il
2-arachidonilglicerolo (2-AG) e più recentemente il 2-arachidonil gliceril
etere (noladin etere) sono stati identificati nei tessuti dei mammiferi (Figura
3) (Devane e coll., 1992; Mechoulam e coll., 1995; Sugiura e coll., 1995;
Stella e coll., 1997; Martin e coll., 1999; Hanus e coll., 2001). Per
l’anandamide e per il 2-AG è stato descritto un meccanismo di ricaptazione
sinaptico, attraverso un carrier (trasportatore di membrana
dell’anandamide-AMT) e la successiva idrolisi all’interno della cellula, ad
acido arachidonico ed etanolamide, ad opera dell’enzima anandamide
amidoidrolasi (o amide idrolasi degli acidi grassi, FAAH) (Di Marzo e
coll., 2000) (Figura 4).
L’insieme dei recettori per i cannabinoidi, degli endocannabinoidi e degli
enzimi che partecipano alla loro in attivazione è definito “sistema
cannabinoide endogeno” (Di Marzo e coll., 2000).
I farmaci che influenzano il sistema cannabinoide endogeno attualmente
noti possono essere divisi in tre classi principali: agonisti recettoriali, 13
Figura 3. Struttura chimica dei cannabinoidi endogeni
Noladin Etere
2- Arachidonilglicerolo
Anandamide 14
Figura 4. Meccanismo d’azione ed inattivazione dell’anandamide
anandamide
Risposta biologica
anandamide
etanolamina
Acido arachidonico
CB AT
FAAH FAAH
extracellulare
intracellulare
γ α
β
AM 404
AM 37415
antagonisti recettoriali ed inibitori della ricaptazione enzimatica e della
degradazione dell’anandamide.
Gli agonisti, in base alla loro struttura chimica, sono solitamente classificati
in quattro classi principali: classici, non classici, aminoalchilindoli ed
eicosanoidi (Nocerino e coll., 2000; Pertwee e Ross, 2002; Reggio, 2002).
I cannabinoidi classici sono derivati dibenzopiranici. Appartengono a
questo gruppo i cannabinoidi di origine vegetale ∆9
–THC, ∆8
–THC, il
cannabinolo ed i loro analoghi sintetici come HU-210 (11-idrossi-∆8
–THCdemetileptil).
Il ∆9
–THC ed il ∆8
–THC si legano sia ai recettori CB1
(agonisti parziali) che ai recettori CB2 (Pertwee e Ross, 2002; Reggio,
2002). L’analogo sintetico HU210, si lega ad entrambi i tipi di recettori e
manifesta effetti farmacologici eccezionalmente lunghi.
I cannabinoidi non classici sono analoghi ciclici e biciclici del ∆9
–THC
privi dell’anello piranico (Nocerino e coll., 2000). Il prototipo è
rappresentato dal CP 55,940 potente agonista di entrambi i tipi di recettori
dei cannabinoidi (Figura 5). I derivati aminoalchilindolici sono
strutturalmente differenti dai due gruppi precedenti (Pertwee e Ross, 2002).
Tra i composti più rappresentativi ricordiamo il WIN 55,212-2 dotato di
alta affinità per i recettori CB1 e CB2 ed il JWH-015 che mostra elevata
affinità per i recettori CB2 (Pertwee e Ross, 2002; Howlett e coll., 2002;
Reggio, 2002) (Figura 5). 16
Figura 5. Struttura chimica dei farmaci cannabinoidergici
O
Me
Me
Me
OH
OH
HO
OH
Me Me
N
O
Me
N
O
O
N
OH
H
O
Me
O
N
N
NH
N
Cl
Cl
Cl
Me
N
N
NH
Me
O
Cl
∆9-THC CP55,940
WIN 55,212-2 anandamide
SR141716A SR14452817
Figura 5. Struttura chimica dei farmaci cannabinoidergici (segue)
VDM11
Me
N
H
O
AM 404 ( Cat.Number 1116 )
O
H
N
OH
IC50:0.7 JuM
ATFMK
O
CF3
IC50:nM
AM 347
O
O
F
S
VDM11 AM404
ATFMK AM34718
Gli eicosanoidi comprendono i cannabinoidi isolati nei tessuti animali ed i
loro analoghi. A questo gruppo appartengono l’anandamide, il 2-AG, il
noladin etere ed altri analoghi sintetici (Pertwee, 2000; Mechoulam e coll.,
2002) L’anandamide si comporta da parziale agonista dei recettori CB1 e
mostra una minore attività intrinseca sui recettori CB2 rispetto ai recettori
CB1 (Pertwee, 2000; Pertwee e Ross, 2002). Tramite modifiche strutturali
sono stati derivati degli analoghi come la metanandamide, l’arachidonil-2-
cloretilamide (ACEA) e l’arachidonilciclopropilamide (ACPA) ad azione
selettiva sul recettore CB1 (Pertwee e Ross, 2002; Howlett e coll., 2002). Il
secondo cannabinoide endogeno 2-AG è agonista di entrambi i recettori dei
cannabinoidi e come l’anandamide mostra una marginale maggiore attività
intrinseca sui recettori CB1 rispetto ai recettori CB2 (Pertwee, 2000;
Howlett e coll., 2002; Mechoulam e coll., 2002). Il noladin etere, isolato di
recente è il meno conosciuto degli endocannabinoidi ed appare un agonista
selettivo dei recettori CB1 (Hanus e coll., 2001).
Gli studi intrapresi in questo campo da Sanofi-Recherche (Montpellier,
Francia) hanno portato alla sintesi di due antagonisti selettivi dei recettori
CB1 e CB2 entrambi molto attivi chiamati rispettivamente SR141716A e
SR144528 (Pertwee e Ross, 2002; Howlett e coll., 2002) Analoghi
strutturali dell’SR141716A sono AM251 ed AM281 che manifestano una
minore potenza. 19
Alcuni composti sono in grado di inibire l’inattivazione degli
endocannabinoidi e di conseguenza di incrementare la loro concentrazione
sul sito d’azione. Lo sviluppo di farmaci basati su tale meccanismo
d’azione può presentare vantaggi, poiché essi agiscono solo quando la
trasmissione viene attivata e solo là dove gli endocannabinoidi sono
presenti. Attualmente sono stati studiati alcuni inattivatori del trasporto
(ricaptazione) dell’anandamide, quali AM404 e VDM11 (Piomelli e coll.,
2000; De Petrocellis e coll., 2000; Giuffrida e coll., 2001; Fowler e coll.,
2002) e dell’enzima FAAH, responsabile della degradazione enzimatica
dell’anandamide con dei suoi analoghi strutturali quali l’arachidonil
trifluorometil-chetone (ATMK), l’AM381 e l’AM374 (De Petrocellis e
coll., 2000; Piomelli e coll., 2000; Giuffrida e coll., 2001) (Figura 5).
Un analogo saturo dell’anandamide è la palmitoiletanolamide (PEA), che è
stata identificata più di 40 anni fa come componente attivo di frazioni ad
attività antinfiammatoria ottenute dall’albume di uovo e dalla lecitina di
soia (Kuehl e coll., 1957); nel 1965 Bachur e collaboratori trovarono la
PEA in diversi tessuti, soprattutto nel cervello, fegato e muscolatura
scheletrica di ratto (Lambert & Di Marzo, 1999). In seguito la PEA è stata
identificata nei macrofagi (Schmid e coll., 1997) e nei leucociti (Bisogno e
coll., 1999) peritoneali, nel plasma di ratto (Giuffrida e Piomelli, 1998), nel 20
cuore di cane (Epps e coll., 1979), nella pelle (Calignano e coll., 1998) e
nel testicolo (Kondo e coll., 1998) di ratto.
La PEA è prodotta a livello tissutale tramite reazioni enzimatiche simili a
quelle dell’anandamide (Di Marzo e coll., 1994) e può essere rilasciata con
l’anandamide in seguito a depolarizzazione dei neuroni (Di Marzo e coll.,
1994; Izzo e coll., 2000a).
Due vie biosintetiche sono state proposte per la PEA (Figura 6). La prima
prevede la condensazione dell’etanolamide e dell’acido palmitico ed è
catalizzata da una sintetasi. Poiché sono necessarie concentrazioni
millimolari dei due substrati affinchè l’enzima riesca a catalizzare la
reazione (probabilmente perché la sintetasi catalizza normalmente la
reazione inversa, ovvero l’idrolisi della PEA), è stata proposta un’altra via
biosintetica. Questa prevede l’idrolisi di un precursore fosfolipidico, l’Npalmitoil-fosfatidiletanolamide
(NPPE), catalizzata da una fosfolipasi. A
sua volta l’NPPE è prodotto dall’aggancio di un radicale palmitico
sull’amino-gruppo della fosfatidiletanolamina, reazione catalizzata da un
aciltransferasi calcio dipendente. 21
Figura 6. Biosintesi della Palmitoiletanolamide (PEA)
Pal
Pal
P X
+ R2
P
R1
O
NH2
Ca Transacilasi 2+
Pal
P X
OH
R2
P
R1
O NH Pal
Fosfolipasi
H2O
R2
P
R1
OH
+ HO NH Pal
PEA
NH2
Pal OH
Etanolamide
Idrolasi H2O 22
La PEA possiede diverse attività biologiche simili all’anandamide, ma
diversamente dall’anandamide non si lega efficientemente ai recettori dei
cannabinoidi CB1 e CB2 (Lambert e Di Marzo, 1999); la PEA, come
l’anandamide, riduce l’attività spontanea nel topo (Adams e coll., 1995),
possiede attività analgesica (Calignano e coll., 1998), antiiinfiammatoria
(Berdyshev e coll., 1998) ed è in grado di rilassare in vitro l’arteria
mesenterica di ratto (White e Hiley, 1998).
I cannabinoidi hanno una grande varietà di effetti biologici e le potenziali
applicazioni terapeutiche di interesse storico e contemporaneo includono il
trattamento del dolore, dell’asma, dei disturbi neurodegenerativi e
muscoloscheletrici, glaucoma, infiammazione e cancro. Benché gli studi
sulla biochimica, fisiologia e patofisiologia del sistema endocannabinoide
siano ancora agli inizi appare chiaro che una modulazione farmacologica
del sistema cannabinoide possa fornire nuovi farmaci per il trattamento di
diverse patologie.
Le attuali conoscenze del sistema cannabinoide endogeno suggeriscono che
potrebbero essere valutate potenziali applicazioni terapeutiche dei
cannabinoidi nel trattamento del dolore, nelle malattie neurodegenerative e
muscoloscheletriche, nell’obesità, nella cirrosi epatica, nel glaucoma, nelle 23
malattie infiammatorie ed in alcune patologie dell’apparato digerente
(Nocerino e coll., 2000 Pertwee e coll., 2001; Pinto e coll., 2002a). 24
2.0 BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA ED OBIETTIVO DELLA
RICERCA
In studi precedenti condotti, in vitro ed in vivo è stato dimostrato che
l’attivazione dei recettori CB1 riduce la motilità intestinale. Gli studi in
vitro hanno mostrato che l’attivazione di tali recettori determina un’
inibizione della trasmissione eccitatoria nell’ileo di cavia (Izzo e coll.,
1998a) e tale effetto è associato ad una diminuzione del rilascio di
acetilcolina dai neuroni enterici (Coutts e Pertwee, 1997) e ad una
riduzione dell’efficienza della peristalsi intestinale (Izzo e coll., 2000c),
inoltre studi in vivo hanno evidenziato che in condizioni fisiologiche
l’attivazione di tali recettori riduce la motilità intestinale (Izzo e coll.,
2000b) e la svuotamento gastrico (Izzo e coll., 1999a).
Tuttavia questi studi non hanno chiarito il ruolo dei cannabinoidi endogeni
nella regolazione della motilità intestinale in condizioni patologiche.
L’obiettivo della nostra ricerca è stato quello di studiare il ruolo del sistema
endocannabinoide endogeno nella regolazione della secrezione e della
motilità in vivo in condizioni patologiche, diarrea indotta da tossina
colerica e infiammazione intestinale. A tal fine sono stati valutati gli effetti
di 1) agonisti ed antagonisti recettoriali ed inibitori dell’inattivazione
dell’anandamide; 2) misurati i livelli intestinali degli endocannabinoidi; 3)
valutata l’attività dell’enzima anandamide amidoidrolasi; 4) identificati,
mediante tecniche di Western blot e tecniche di immunoistochimica, i 25
recettori dei cannabinoidi CB1 nell’intestino tenue di topo; 5) quantificati i
livelli di mRNA dei recettori CB1 mediante retrotrascrizione e reazione a
catena della polimerasi (RT-PCR).
L’obiettivo finale è stato quello di identificare nuovi bersagli molecolari
per lo sviluppo di composti capaci di regolare la secrezione e la motilità
intestinale in condizioni patologiche attraverso una modulazione
farmacologica del sistema cannabinoide endogeno. 26
3.0 MATERIALI E METODI
3.0.1 Animali
Per i nostri studi sono stati utilizzati topi ICR (Harlan Italy, San Pietro al
Natisone, Udine, Italy) di sesso maschile (18-22 g).
I topi sono stati alimentati ad libitum con una dieta standard fornita dalla
ditta Mucedola Mangimi, Settimo Milanese (MI) tranne che nelle 16 ore
precedenti l’esperimento. I topi avevano libero accesso all’acqua durante le
16 ore di digiuno ma questa veniva allontanata dopo la somministrazione
della CT.
Tutti gli animali prima di essere utilizzati per gli esperimenti sono stati
lasciati stabulare per 7 giorni alle seguenti condizioni: temperatura 23±2°
C, umidità 60%, cicli di luce-buio di 12 ore.
3.0.2 Accumulo di fluido intestinale indotto dalla tossina colerica
La valutazione dell’accumulo di fluido intraluminale nell’intestino tenue è
stata eseguita mediante la tecnica dell’enteropooling. La tossina colerica
(CT) (10 µg /topo in 0.3 ml di TRIS buffer 0.05 M, pH 7,4) è stata
somministrata mediante un sondino orogastrico. Dopo 6 ore l’intero
intestino dal piloro alla valvola ileo-cecale è stato isolato e manipolato con
cura per evitare la rottura del tessuto e la perdita di fluido. I tessuti
mesenterico e connettivo sono stati rimossi e l’intestino è stato
opportunamente essiccato. 27
L’accumulo di fluido è stato espresso come:
(W1-W2)x 10-6 /W2
dove W1 è il peso dell’intestino dopo il prelievo e W2 è il peso
dell’intestino dopo l’espulsione del contenuto (Rivière e coll., 1991). La
dose di CT ed altri dettagli sperimentali sono stati selezionati sulla base di
precedenti studi presenti in letteratura (Gabriel e coll., 1994).
Il CP55,940 (0.03-3 mg/kg), l’ACEA (0,1-10 mg/kg), il JWH-015 (1-10
mg/kg), l’SR141716A (0.1-3 mg/kg), l’SR144528 (0.1-3 mg/kg), il
VDM11 (10 mg/kg), la clorisondamina (5 mg/kg), la capsazepina (3-30
mg/kg) o il veicolo [salina, dimetilsolfossido (DMSO), o etanolo, 10
µl/topo] sono stati somministrati intraperitonealmente (ip) 30 minuti prima
della somministrazione della tossina colerica (o del veicolo).
In altri esperimenti gli antagonisti dei recettori dei cannabinoidi
(SR141716A o SR144528 a dosi di 0.3 e 3 mg/kg rispettivamente) o la
clorisondamina (5mg/kg) sono stati somministrati (ip) 30 minuti prima
degli agonisti. Le dosi del VDM11 e della clorisondamina sono state scelte
in base a precedenti studi presenti in letteratura (Delbro e Lange, 1997;
Pinto e coll., 2002b ). 28
3.0.3 Transito intestinale nel tenue
Il transito intestinale nel tenue è stato studiato utilizzando la tecnica
descritta da Izzo e coll. (2000b). In pratica gli animali erano tenuti a
digiuno per 6 ore prima della misurazione del transito e per 18 ore prima
dell’induzione della flogosi intestinale. Durante il digiuno, gli animali
venivano posti in gabbie munite di una rete a maglie larghe posta 5 cm al
di sopra del pavimento per facilitare la caduta delle feci e impedire la
coprofagia. Dopo 30 minuti dalla somministrazione delle sostanze in
esame, tutti gli animali ricevevano, mediante sondino gastrico, 0.2 mL di
una sospensione di carbone vegetale (marker) al 10%, in gomma arabica al
5%. Venti minuti dopo la somministrazione del marker gli animali erano
sacrificati in ambiente di CO2 e la distanza percorsa dal carbone veniva
misurata a partire dal piloro, sia negli animali di controllo che in quelli
trattati. I risultati sono stati espressi come percentuale della distanza
percorsa dal marker rispetto alla lunghezza dell’intestino tenue.
Il CP 55,940 ( 0.0003-0.1 mg/kg) , il cannabinolo (0.1-30 mg/kg) e la PEA
(2.5-30 mg/kg) o il veicolo [dimetilsolfossido (DMSO), o etanolo] sono
stati somministrati intraperitonealmente (ip) 20 minuti prima della 29
somministrazione del marker (o del veicolo).
In altri esperimenti gli animali, 30 minuti prima della somministrazione
della PEA e degli agonisti dei cannabinoidi CP 55,940 e cannabinolo erano
pretrattati per via intraperitoneale con gli antagonisti dei recettori dei
cannabinoidi (SR141716A o SR144528 a dosi di 0.3 e 1 mg/kg
rispettivamente), la clorisondamina (5mg/kg), l’ esametonio (1 mg/kg), la
ioimbina (1 mg/kg), il naloxone (2 mg/kg), L-NAME (25 mg/kg). In altri
esperimenti gli animali, 10 minuti prima della somministrazione della PEA
erano pretrattati per via intraperitoneale con PMSF (30 mg/kg). Queste
dosi sono state stabilite sulla base di precedenti lavori (Santos e Rao, 1999;
Izzo e coll., 2001b; Wiley e coll., 2000).
Il transito intestinale nel tenue è stato studiato anche in animali a cui
veniva prodotto uno stato flogistico. L’infiammazione è stata indotta
pretrattatando gli animali con 0.02 mL di olio di croton per due giorni
consecutivi; il quarto giorno dopo la prima somministrazione di olio di
croton, veniva misurato il transito (Puig e Pol, 1998). 30
3.0.4 Colite ulcerosa in pazienti
Per i nostri esperimenti i tessuti provenienti da 8 pazienti di controllo [5
maschi e 3 femmine (età 41.5±17.5): 3 pazienti con ematochezia, 3 con
carcinoma del colon (diagnosi negativa), 3 con dolori addominali] ed 8
pazienti affetti da colite ulcerosa (6 maschi e 2 femmine di età 49.8 ±17.1).
I tessuti bioptici venivano conservati a -80°C prima del dogaggio.
3.0.5 Western blot
Il digiuno è stato omogenato in un tampone contenente: 100 mM di
HEPES, NaCl 1M, 200 mM di EDTA, 100 mM di EGTA, ditiotreitolo 1M,
100 mM di PMSF, 15/ml di inibitore della tripsina, 750 µl/ml di pepstatina
A, 10 mM di benzamidina 10, glicerolo al 20 % v/v, 100 mM di MgCl2, 1%
di Nonidet P40, H20, con un omogeneatore di vetro ed un pestello di teflon.
L’omogenato è stato centrifugato a 4°C a 13,000 rpm per 15 minuti ed il
surnatante è stato separato, aliquotato e conservato a –80°C. La
concentrazione delle proteine è stata determinata con il metodo Bio-Rad.
L’elettroforesi è stata eseguita come descritto precedentemente da Melk e
collaboratori (2000). Un equivalente di 100 µg di proteine provenienti
dall’omogenato intestinale sono state separate su gel di poliacrilamide
SDS-PAGE. Le proteine sono state poi trasferite su membrane di
nitrocellulosa. Le membrane sono state poi saturate con un tampone 31
contenente “non fat dry milk” in PBS e incubate per tutta la notte a 4°C con
un anticorpo specifico (anti-CB1 dil. 1:800; Cayman Chemicals). Dopo
ripetuti lavaggi con PBS contenente Triton X-100 all’1% queste sono state
incubate con un anticorpo secondario anti-IgG di coniglio (per CB1 e CB2)
coniugato ad una perossidasi per 1 h a temperatura ambiente. Infine le
bande proteiche sono state visualizzate mediante chemioluminescenza
(ECL; Amersham), scannerizzate ed analizzate attraverso un densiometro
GS 700 (Bio-Rad) ed un programma computerizzato (Molecular Analyst
IBM).
3.0.6 Dosaggio degli endocannabinodi
L’intestino tenue dei topi di controllo e di quelli trattati con CT è stato
prelevato (6 ore dopo la somministrazione orale di CT o del veicolo) ed il
tessuto bioptici prelevato da pazienti di controllo che con colite ulcerosa
era pesato ed immerso in azoto liquido, conservato a –70° e
immediatamente trasferito presso i laboratori del CNR (Dott. V. Di Marzo)
di Arco Felice (NA). Qui il tessuto è stato estratto con una miscela di
cloroformio/metanolo (2:1) contenente 1 nmole di d8-anandamide, d4-
palmitoiletanolamide e d8-2-arachidonilglicerolo, sintetizzati come
descritto da Bisogno e collaboratori (1997). I lipidi estratti sono stati
separati su colonna cromatografica di silice e poi su HPLC (Bisogno e
coll., 1997). Le frazioni corrispondenti 32
all’anandamide/palmitoiletanolamide (tempo di ritenzione 26-27 minuti) o
al 2-arachidonilglicerolo (tempo di ritenzione 18-22 minuti) sono state
analizzate mediante gas-cromatografia e spettrometria di massa (GC-MS)
(Bisogno e coll., 1999). I risultati sono stati espressi come pmol/g o nmol/g
di tessuto fresco.
3.0.7 Attività dell’enzima anandamide amidoidrolasi
Per misurare l’attività dell’anandamide amidoidrolasi è stata utilizzata
l’anandamide marcata [14C] (5 mCi nmol-1) sintetizzata come descritto da
Bisogno e collaboratori (1997) a partire da [14C] etanolamina ed acido
arachidonico a concentrazioni di 10 µM. Sono state dosate frazioni di
membrana ottenute da segmenti di intestino provenienti da animali di
controllo e da animali quelli trattati con CT (Bisogno e coll., 1999). Il
saggio è stato eseguito in 50nmol/L di Tris –HCl, pH 9, a 37°C per 30
minuti. L’etanolamina [14C] prodotta dalla reazione di degradazione
dell’anandamide [14C] è stata misurata come precedentemente descritto
(Bisogno e coll., 1997). L’attività è stata espressa come pmol di
etanolamina [14C] prodotta per min/mg di proteine.
3.0.8 Immunoistochimica
I campioni ottenuti dagli animali di controllo e da quelli trattati con CT
sono stati prelevati (6 ore dopo la somministrazione orale di CT o del 33
veicolo) dalla porzione intermedia del digiuno. Il materiale è stato
immediatamente fissato per 2 h, in paraformaldeide sciolta al 2% in
soluzione salina tamponata (PBS), 0.1 M, a pH 7.4 in ghiaccio. Dopo
fissazione, i campioni sono stati lavati diverse volte in PBS e poi messi in
soluzioni crescenti di saccarosio disciolto in PBS (dal 10 al 30%) e
conservati in frigo a 4°C. Quindi il materiale è stato congelato e conservato
in azoto liquido fino al successivo taglio al criostato. Le sezioni criostatate
di 10 µm di spessore sono state montate su vetrini portaoggetto pretrattati
con Vectabond (Vector, Burlingame, CA).
Le sezioni criostatiche contenenti il plesso mienterico sono state sottoposte
al protocollo di immunofluorescenza di semplice e doppia marcatura.
Sono stati utilizzati due anticorpi policlonali ottenuti in coniglio e diretti
contro la porzione N-terminale del recettore CB1 a sequenza umana ( 1-14
aa e 1-16 aa rispettivamente), acquistati dalla Cayman Chemicals
(diluizione di 1: 600; Ann Arbor, Michigan, USA) e dalla Biosource Int
(diluizione di 1: 250; Camarillo, CA, USA) applicati da soli sulle sezioni, o
diluiti con un anticorpo policlonale ottenuto da capra, che riconosce e si
lega all’enzima acetilcolintransferasi (ChAT) umano diluito 1:50
(Chemicon International, Temecula, CA, USA). Le incubazioni secondarie
comprendevano anticorpi (immunoglobuline G ottenute da asino: Jackson
Immunoresearch, West Grove, PA, USA) coniugati rispettivamente ai 34
fluorocromi: isotiocianato di fluoresceina (FITC), con Rosso RodaminaTMX
e con l’acido 7 amino-4 metilcumarin 3 acetico (AMCA).
In breve le sezioni di tessuto venivano reidratate in PBS (pH 7.4) per 10
minuti, incubate in Triton X-100 allo 0,4% e albumina bovina al 3%
(Sigma Chemical Co., ST. Louis, MO, USA) in PBS per 30 minuti per
bloccare il legame non specifico (Mascolo e coll., 2002; Pinto e coll.,
2002b). Le sezioni venivano simultaneamente incubate con due anticorpi
primari ottenuti in coniglio ed in capra rispettivamente, per tutta la notte a
temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi in PBS, le sezioni venivano
simultaneamente incubate per 1 ora al buio con l’anticorpo secondario
diluito nello stesso buffer, coniugato con i fluorocromi FICT ed AMCA.
Dopo diversi lavaggi in PBS, le sezioni sono state montate con Vectashield
(Vector Laboratori, Burlingame, CA, USA). Tutti gli anticorpi usati sono
stati diluiti in soluzioni di PBS contenenti IgG di topo e di asino al 3%.
Sono state anche valutate possibili reazioni crociate tra gli anticorpi
secondari ed i primari delle diverse specie. Tutti i controlli hanno dato
risultati negativi.
Le sezioni tissutali sono state osservate con un microscopio Nikon Eclipse
600, provvisto di lampada a mercurio di 100W. I fotogrammi sono stati
ottenuti con un sistema fotografico Nikon. Sono state usate pellicole
trasparenti Provia 400 (Fuyj, Tokio, Japan). Le immagini scelte sono state
scannerizzate con uno scanner FS 2710 (Canon Inc, Japan) e 35
successivamente mediante il programma Adobe Photoshop (ver. 6) si sono
allestite le tavole fotografiche.
3.0.9 Analisi RT-PCR semi-quantitativa
L’RNA totale dalla parte intermedia del digiuno di ogni animale (sei ore
dopo la somministrazione orale della CT o del veicolo) è stato estratto
usando il reagente Trizol. Dopo l’estrazione, l’RNA è stato precipitato
usando isopropanolo freddo e successivamente risospeso in acqua RNAasefree
(Sigma). L’integrità dell’RNA è stata analizzata mediante elettroforesi
su gel di agarosio all’1% contenente bromuro di etidio. L’RNA è stato poi
trattato con DNAsi I RNAse-free (kit Ambion DNA-free™t) per digerire il
DNA genomico contaminante e successivamente per rimuovere la DNAsi
ed i cationi bivalenti.
L’espressione dell’mRNAs per la GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato
deidrogenasi) e per i recettori CB1 è stata studiata mediante
retrotrascrizione e reazione a catena della polimerasi (RT-PCR). L’RNA
totale è stato retrotrascritto usando oligo dT come primers.
L’amplificazione del DNA è stata ottenuta in un buffer per PCR (QBiogen)
contenente 2µl di cDNA, 500 µM di dNTP, 2 mM di MgCl2, 0.8
µM di ogni primer e 0.5 U di Taq polimerasi (Q-Biogen).
Le tappe della reazione a catena erano: i) denaturazione a 94°C per 1 min;
ii) appaiamento a 60°C per 1 min; iii) estensione a 72°C per 1 min. E’ stata 36
poi fatta un’estensione finale di 10 minuti a 72°C. I cicli PCR di
amplificazione sono stati 30. La reazione è stata fatta in un PE Gene Amp
PCR Sistema 9600 (Perkin Emer). Dopo la reazione gli amplificati sono
stati sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio al 2% contenente bromuro
di etidio ed osservati successivamente all’UV.
Gli oligonucleotidi specifici sono stati sintetizzati sulla base delle sequenze
di cDNA della GAPDH e dei recettori CB1 comuni al ratto ed al topo. Per
la GAPDH, le sequenze dei primers erano 5’-
CCCTTCATTGACCTCAACTACATGGT-3’ (nt 208-233; sense) e 5’-
GAGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’ (nt 655-677; antisense). I primers
CB1 sense e antisense erano 5’-GATGTCTTTGGGAAGATGAACAAGC-
3’ (nt 365-373) e 5’-AGACGTGTCTGTGGACACAGACATGG-3’ (nt
460-468), rispettivamente. Le dimensioni dei frammenti amplificati erano
470 bp per la GAPDH e 309 bp per i CB1. L’espressione del gene per la
GAPDH è stata utilizzata per valutare le variazioni nel contenuto di RNA e
nella sintesi di cDNA per le differenti preparazioni. Nessun prodotto della
PCR era ottenuto quando la tappa della retrotrascrizione veniva eliminata
(dati non mostrati).
3.1.0 Farmaci utilizzati
Sono stati utilizzati i seguenti farmaci: l’ACEA [(all Z)-N-(2-cloroetil)-
5,8,11,14-eicosatetraenamide)], il CP55,940 (-)-cis-3-[2-Hydroxy-4-(1,1-37
dimethylheptyl)phenyl]-trans-4-(3-hydroxypropyl)cyclohexanol, JWH-015
(2-metil-1-propil-1H-indol-3-yl)-1-naftalenilmetanone, la clorisondamina e
la palmitoiletamolamide acquistati presso la ditta Tocris Cookson (Bristol,
UK). La tossina colerica (da Vibrio cholerae), l’esametonio, il cannabinolo,
la ioimbina, il naloxone, l’estere metilico della NG-nitro-L-arginina (LNAME),
il fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e la capsazepina sono state
acquistate dalla ditta Sigma Chemical Co. (Milano, Italia). L’SR141716A
[(N-piperidin-1-yl)-5-(4-clorofenil)-1-2,4-diclorofenil)-4-metil-1Hpirazolo-3-carboxamide
cloridrato] e l’SR144528 (N-[-1S-endo-1,3,3-
trimetil biciclo[2.2.1] eptan-2-yl]-5-(4-cloro-3-metilfenil)-1-(4-
metilbenzil)-pirazolo-3-carboxamide) sono stati forniti dalla Dott.ssa
Madaleine Mossè e da Francis Barth (SANOFI-Recherche, Montpellier,
France). Il composto VDM11 [(all Z) N-(2-metil-3-idrossi-fenil)-5,8,11,14-
eicosa-tetraenamide] è stato fornito dal Dott. V. Di Marzo [CNR di Arco
Felice (NA)] (De Petrocellis e coll., 2000).
Il CP55,940, il JWH-015, la capsazepina, l’SR141716A e l’SR144528 sono
stati solubilizzati in dimetilsolfossido (DMSO); l’ACEA ed il VDM11 sono
stati solubilizzati in etanolo, mentre la clorisondamina in fisiologica. Il
DMSO e l’etanolo, alle concentrazioni di 10 µL/topo ip, non avevano alcun
effetto significativo sulla secrezione intestinale.38
3.1.1 Analisi statistica
I risultati rappresentano la media ± e.s degli esperimenti. Per determinare la
significatività statistica, sono stati usati il t-test di Student (differenza tra
due medie) e l’analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer
(differenza tra più di due medie). Un valore di P<0.05 è stato considerato
statisticamente significativo. 39
4.0 RISULTATI
4.1 Accumulo di fluido intestinale indotto dalla tossina colerica
La somministrazione orale della CT (10 µg/topo) determinava un
significativo accumulo di fluido nell’intestino tenue (Figura 7). Gli agonisti
dei recettori dei cannabinoidi ACEA (0.1-10 mg/kg,) e CP55,940 (0.03-3
mg/kg) producevano una riduzione dose-dipendente dell’accumulo di
fluido intraluminale (Figura 8).
Il composto SR141716A (0.3 mg/kg), un antagonista dei recettori CB1,
annullava l’effetto dell’ACEA (10 mg/kg) e del CP55,940 (0.3 mg/kg),
mentre l’SR144528, un antagonista dei recettori CB2, (3 mg/kg) non aveva
alcun effetto (Figura 9). L’accumulo di fluido indotto dalla CT (µg/g tenue:
CT, 221±25; CT + JWH-015, 239±21; n=8, P>0.2 vs CT) non era però
modificato dall’agonista selettivo dei recettori CB2, JWH-015 (10 mg/kg).
Inoltre la somministrazione della capsazepina un’antagonista dei recettori
VR1 dei vanilloidi, non modificava l’accumulo di fluido indotto dalla CT
(µg/g di intestino tenue: CT, 231±211; CT+capsazepina 3 mg/kg, 228±19;
capsazepina 10 mg/kg, 235±22; capsazepina 30 mg/kg, 219±20; n=10-12;
P>0.2 vs CT).
La clorisondamina (5 mg/kg), un bloccante gangliare, somministrata da
sola riduceva l’effetto della CT di circa il 50%. Quando il CP55,940 (1
mg/kg) veniva somministrato dopo la clorisondamina, inibiva in maniera
significativa (P<0.05) l’accumulo 40
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
controllo
Tossina colerica (CT)
0.03 0.1 0.3 1 3 mg/kg
**
*
CT + CP55,940
**
#
Accumulo di Fluido
(µg/g di intestino tenue)
Figura 7. Effetto del CP55,940 (0.03-3 mg/kg, ip) sull’accumulo di fluido
indotto dalla tossina colerica (CT). L’accumulo di fluido è stato misurato 6
ore dopo la somministrazione della CT (10 µg/topo per os). Ogni punto
rappresenta la media ± SEM di 10-12 topi. #P<0.01 vs controllo; *P<0.05 e
P<0.01 vs CT.41
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
controllo
Tossina colerica (CT)
0.1 0.3 1 3 10 mg/kg
*
CT + ACEA
#
Accumulo di Fluido
(µg/g di intestino tenue)
Figura 8. Effetto dell’ACEA (0.1-10 mg/kg, ip) sull’accumulo di fluido
indotto dalla tossina colerica (CT). L’accumulo di fluido è stato misurato 6
ore dopo la somministrazione della CT (10 µg/topo per os). Ogni punto
rappresenta la media ± SEM di 10-12 topi. #P<0.01 vs controllo; *P<0.05
vs CT.42
0
50
100
150
200
250
300
controllo
Tossina colerica (CT)
CT + CP55,940
SR1 SR2
*
CT + ACEA
#
°
Accumulo di Fluido
(µg/g di intestino tenue)
Figura 9. Accumulo di fluido indotto dalla CT nel topo.
Effetto antisecretorio del CP55,940 (0.3 mg/kg, ip) e dell’ACEA (10
mg/kg, ip) da soli o in topi protrattati con l’antagonista dei recettori CB1
SR141716A (SR1, 0.3 mg/kg, ip) o con l’antagonista dei recettori CB2
SR144528 (SR2, 3 mg/kg, ip). L’accumulo di fluido è stato misurato 6 ore
dopo la somministrazione della CT (10 µg/topo per os). Ogni punto
rappresenta la media ± SEM di 10-12 topi. #P<0.01 vs controllo; *P<0.05
vs CT, °P<0.05 vs CP55,940 (o ACEA).43
di fluido indotto dalla CT (µg/g di intestino tenue: controllo, 128±21; CT,
235±26; CT + clorisondamina, 178±15; CT + clorisondamina + CP55,940;
131±21; n=8-10).
L’SR141716A (0.1-3 mg/kg) somministrato da solo, determinava un
incremento dose-dipendente dell’accumulo di fluido intraluminale, un
effetto che era statisticamente significativo a dosi di 1 mg/kg (Figura 10).
Al contrario il composto SR144528 (0.1-3 mg/kg), non modificava
significativamente l’accumulo di fluido indotto dalla CT.
Il composto VDM11 (10 mg/kg), un inibitore selettivo della ricaptazione
dell’anandamide, riduceva significativamente l’accumulo di fluido indotto
dalla CT e questo effetto era antagonizzato da una dose inattiva di
SR141716A (0.3 mg/kg) (Fig. 5). Ad alte dosi il CP55,940, l’ACEA
l’SR141716A, il VDM11, la capsazepina ed il JWH-015 non modificavano
l’accumulo di fluido intestinale negli animali di controllo (animali che
ricevevano il veicolo usato per solubilizzare la CT) (dati non mostrati).
4.2 Valutazione dei livelli degli endocannabinoidi e dell’attività
dell’anandamide amidoidrolasi
Nella Tabella 1 sono riportati i livelli di endocannabinoidi, cioè
anandamide, 2-arachidonilglicerolo (2-AG) e palmitoiletanolamina (PEA)
nell’intestino tenue dei topi di controllo e trattati con CT. Come si può
osservare i livelli di anandamide ma non di 2-AG o PEA aumentavano44
0
50
100
150
200
250
300
controllo
Tossina colerica (CT)
0.1 0.3 1 3
**
**
CT + SR141716A
CT + SR144528
#
mg/kg
Accumulo di Fluido
(µg/g di intestino tenue)
Figura 10. Effetto dell’antagonista dei recettori CB1 SR141716A (SR1,
0.1-3 mg/kg, ip) e dell’antagonista dei recettori CB2 SR144528 (SR2, 0.1-3
mg/kg, ip) sull’accumulo di fluido indotto dalla CT nel topo. L’accumulo
di fluido è stato misurato 6 ore dopo la somministrazione della CT (10
µg/topo per os). Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 10-12 topi.
#P<0.01 vs controllo; **P<0.01 vs CT.45
0
50
100
150
200
250
controllo
Tossina colerica (CT)
CT + VDM11
*
#
CT + VDM11 + SR14176A
°
Accumulo di Fluido
(µg/g di intestino tenue)
Figura 11. Effetto dell’inibitore del re-upteke dell’anandamide VDM11
(10 mg/kg, ip) da solo o in topi protrattati con l’antagonista dei recettori
CB1 SR141716A (SR1, 0.3 mg/kg, ip) sull’accumulo di fluido indotto dalla
CT nel topo. L’accumulo di fluido è stato misurato 6 ore dopo la
somministrazione della CT (10 µg/topo per os). Ogni punto rappresenta la
media ± SEM di 8-10 topi. #P<0.01 vs controllo; *P<0.01 vs CT; °P<0.01
vs VDM11.46
dopo la somministrazione della CT. L’aumento dei livelli di anandamide
non era dovuto a variazioni della sua idrolisi enzimatica, in quanto non si
osservavano variazioni nei campioni di intestino tenue degli animali trattati
con CT della capacità di idrolizzare la [14C]anandamide (Tabella 1).
4.3 Immunoistochimica
Mediante l’immunofluorescenza indiretta di marcatura semplice è stato
possibile dimostrare che nell’intestino tenue degli animali di controllo, i
recettori CB1 sono distribuiti sui corpi neuronali e sulle fibre nervose del
plesso mienterico, (Figura 12a) e, più raramente, sulle fibre nervose della
lamina sottomucosa. Pochi recettori CB1 sono stati localizzati sulle fibre
nervose che innervano la muscolatura circolare. L’immunofluorescenza
indiretta di doppia marcatura, ha mostrato la presenza dei recettori CB1 sui
corpi neuronali e sulle fibre nervose mienteriche, che risultavano
immunoreattive anche alla acetilcolintransferasi (ChAT) (Figura 12a-a’),
enzima utilizzato come marker rivelatore dei neuroni colinergici.
Negli animali trattati con la CT si osservava un lieve aumento della densità
dei recettori CB1, espressi dai neuroni del plesso mienterico, dalle fibre
nervose della muscolatura circolare e dai neuroni del plesso sottomucoso.
(Figura 12b). Colorazioni di doppia marcatura hanno confermato la
presenza dei recettori CB1 sui neuroni colinergici mienterici e sottomucosi
(Figura 12b- b’) immunoreattivi alla ChAT. 47
Tabella 1. Effetto della tossina colerica sui livelli di anandamide, 2-
arachidonil-glicerolo e sulla palmitoiletanolamina e sull’attività
dell’anandamide amidoidrolasi nell’intestino tenue di topo.
I risultati sono la media+SEM di n=4 differenti esperimenti fatti in
duplicato. *P<0.01 vs controllo, come determinato mediante l’ANOVA
seguito dal test di Bonferroni. N.S., differenza significativa vs il controllo,
P>0.05.
Controllo Trattato
Anandamide
(pmol/g tessuto)
33.2+7.2 92.8+4.6*
2-Arachidonil-glicerolo
(nmol/g tessuto)
46.8+8.2 93.8+32.3 (N.S.)
Palmitoiletanolamina
(pmol/g tessuto)
526.0+93.2 458.0+40.0 (N.S.)
Anandamide Amidoidrolasi
(pmol/min x mg proteina)
14.6+1.6 16.2+2.0 (N.S.) 48
Figura 12. (a-a’) Co-localizzazione dei recettori CB1 dei cannabinoidi e
della ChAT (marker colinergico) nelle fibre nervose del plesso mienterico
dei topi di controllo. (b-b’): un’elevata densità recettoriale si può osservare
nei neuroni CB1/ChAT immunoreattivi del plesso mienterico, del plesso
sottomucoso e nelle fibre che innervano la muscolatura circolare dei topi
trattati con la tossina colerica. Calibrazione bar: 200 Mp: plesso
mienterico; Sp plesso sottomucoso ChAT: colina acetil transferasi. 49
4.4 Studio dell’espressione dell’mRNA dei recettori CB1 mediante RTPCR
semiquantitativa
L’analisi su gel di agarosio dei prodotti della RT-PCR dall’RNA totale
dell’intestino di topo ha mostrato una intensa banda corrispondente
all’mRNA dei recettori CB1 (309 bp) e all’mRNA della GAPDH (470 bp)
usando i rispettivi primers. Le bande corrispondenti ai trascritti per il
recettore CB1 sono state analizzate mediante densitometria e normalizzate
utilizzando le bande corrispondenti ai trascritti della GAPDH. I risultati
mostravano bande più intense nei campioni provenienti dai topi trattati con
CT rispetto ai controlli (Figura 13). I nostri dati suggeriscono che
l’aumento di immunoreattività dei recettori CB1 osservato nell’intestino
tenue dei topi trattati con CT è dovuto ad una maggiore espressione dei
recettori CB1 a livello trascrizionale. 50
Figura 13. A: Analisi su gel di agarosio con la tecnica RT-PCR
dell’mRNA totale dell’intestino tenue trattato con il veicolo (C1, C2, C3) o
con la tossina colerica (CT) (T1, T2, T3).
B: come si osserva dall’analisi densitometrica le bande ottenute dall’RNA
dell’intestino tenue dei topi trattati con CT sono più intense rispetto a
quelle ottenute con i topi di controllo (media ± SEM, n=3, P<0.05).
C1 C2 C3 T1 T2 T3 C1 C2 C3 T1 T2 T3
A
Band intensity
(arbitrary units)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
control
cholera toxin
* B
GAPD
H
CB151
4.5 Effetto degli agonisti dei recettori dei cannabinoidi sul transito
intestinale durante un processo infiammatorio
Gli agonisti dei recettori dei cannabinoidi il CP 55,940 e il cannabinolo
inibivano in maniera dose-dipendente il transito gastrointestinale sia negli
animali di controllo che in quelli in cui con infiammazione intestinale.
Come si può osservare dalla Figura 14 in animali con infiammazione
intestinale erano richieste dosi inferiori di agonisti per ottenere una
inibizione significativa della motilità intestinale.
Il composto SR141716A (0.03 mg/kg, ip), antagonista dei recettori CB1 ma
non il composto SR144528 (1 mg/kg, ip) antagonista dei recettori CB2
annullava l’effetto inibitorio del CP 55,940 e del cannabinolo nei topi
trattati con olio di croton (Figura 15).
L’esametonio (1 mg/kg, ip) non modificava significativamente l’effetto di
entrambi gli agonisti iniettati ip nei topi trattati con olio di croton (Figura
15) e somministrato da solo non modificava il transito gastrointestinale
(12±6% di incremento, n=10, P>2). Inoltre l’analisi densitometrica delle
bande immunoreattive mostrava un significativo incremento (P<0.01)
dell’espressione dei recettori CB1 nell’intestino infiammato rispetto a
quello dei topi di controllo (Figura 16). 52
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100
0
15
30
45
60
75
90
CP 55,940
cannabinolo
olio di croton+CP 55,940
olio di croton + cannabinolo
*
***
***
*
**
***
*
**
**
***
Dose (mg/kg)
Transito (%)
Figura 14. . Effetto del CP 55,940 (0.0003-0.1 mg/kg, ip) e del
cannabinolo (0.1-30 mg/kg, ip) sul transito intestinale sia negli animali di
controllo che durante un processo infiammatorio. Ogni punto rappresenta la
media ± SEM di 10-12 animali, *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001 vs
controllo53
0
15
30
45
60
controllo
olio di croton
olio di croton + CP 55,940
**
@
**
#
**
olio di croton + cannabinolo
SR141716A SR144528 esametonio
Transito (%)
Figura 15. Effetto del CP 55,940 (3 µg/kg, ip) e del cannabinolo (1.25
mg/kg) somministrati da soli o in presenza dell’antagonista dei recettori
CB1 SR141716A (SR1, 0.3 mg/kg, ip), dell’antagonista dei recettori CB2
SR144528 (SR2, 1 mg/kg, ip) o dell’antagonista dei recettori nicotinici a
livello gangliare esametonio (1 mg/kg, ip) durante un processo
infiammatorio sul transito intestinale. Ogni punto rappresenta la media ±
SEM di 10-12 animali, @P<0.05 vs controllo, **P<001 olio di croton,
#
P<0.01 vs CP 55,940 (o cannabinolo). 54

0
1
2
3
controllo inflammazione
*
Densitometria O.D.
mm
2
Figura 16. Western blot mostrante l’aumento dell’espressione dei recettori
CB1 nell’intestino sia negli animali di controllo che in quelli trattati con
olio di croton. I risultati sono la media di n= 3 esperimenti
Recettore CB155
4.6 Effetto della palmitoiletanolamide nel controllo della motilità
intestinale in animali in condizioni fisiopatologiche
L’effetto della PEA (2.5-30 mg/kg, ip), sul transito intestinale è mostrato
in figura 17. La PEA era in grado di inibire in maniera dose-dipendente e
significativamente (P<0.05) il transito intestinale. Questo effetto, evidente
sia nel gruppo degli animali di controllo (ED50 PEA: 7.25±0.85 mg kg-1)
che in quello degli animali con infiammazione intestinale (Figura 18), non
veniva modificato da un pretrattamento degli animali con i composti
SR141716A (0.3 mg/kg) e SR144528 (1 mg/kg), antagonisti
rispettivamente dei recettori CB1 e CB2 (Figure 19 e 20). 56
0
15
30
45
60
*
**
**
controllo
PEA
2.5 5 10 20 30 mg/kg
Transito (%)
Figura 17. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA) sul transito
intestinale. Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 10-12 animali,
*P<0.05, **P<0.01 vs controllo. 57
0
20
40
60
*
**
**
#
2.5 5 10 20 30 mg/kg
controllo
olio di croton
olio di croton + PEA
Transito (%)
Figura 18. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA, ip) sul transito
intestinale durante un processo infiammatorio. Ogni punto rappresenta la
media ± SEM di 10-12 animali, #P<0.05 vs controllo; *P<0.05, **P<0.01
vs olio di croton. 58
0
20
40
60
*
*
*
SR141716A
SR144528
controllo
PEA
Transito (%)
Figura 19. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA, 10 mg/kg, ip)
somministrata da sola o in presenza dell’antagonista dei recettori CB1
SR141716A (SR1, 0.3 mg/kg, ip) e dell’antagonista dei recettori CB2
SR144528 (SR2, 1 mg/kg, ip) sul transito intestinale. Ogni punto
rappresenta la media ± SEM di 10-12 animali, *P<0.05 vs controllo. 59
0
20
40
60
SR141716A
SR144528
* * *
#
olio di croton
olio di croton + PEA
controllo
Transito (%)
Figura 20. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA, 10 mg/kg, ip)
somministrata da sola o in presenza dell’antagonista dei recettori CB1
SR141716A (SR1, 0.3 mg/kg, ip) e dell’antagonista dei recettori CB2
SR144528 (SR2, 1 mg/kg, ip) durante un processo infiammatorio sul
transito intestinale. Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 10-12
animali, *P<0.05 vs controllo. 60
Così pure l’effetto inibitorio della PEA non veniva modificato da un
pretrattamento degli animali con L-NAME (25 mg/kg), iombina (1 mg/kg),
naloxone (2 mg/kg), esametonio (1 mg/kg) e PMSF (30 mg/kg) (figure 21,
22, e 23).
I composti SR141716A e SR144528, L-NAME, iombina, naloxone,
esametonio e PMSF somministrati da soli alle stesse dosi non
modificavano il transito del carbone vegetale sia negli animali di controllo
sia in quelli a cui era stato indotto uno stato di flogosi (dati non mostrati).
L’etanolo o il DMSO, usati come veicoli dei farmaci in studio, non
mostravano possedere alle concentrazioni utilizzate nessun effetto sulla
motilità intestinale (dati non mostrati). 61
0
15
30
45
60
naloxone
L-NAME
esametonio
* * *
*
*
controllo
PEAioimbina
Transito (%)
Figura 21. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA, 10 mg/kg, ip)
somministrata da sola o in presenza dell’antagonista dei recettori degli
oppioidi naloxone (2 mg/kg, ip), dell’antagonista dei recettori α-
adrenergici ioimbina (1 mg/kg, ip), dell’antagonista dei recettori nicotinici
a livello gangliare esametonio (1 mg/kg, ip) e dell’ inibitore della sintesi
del monossido d’azoto L-NAME (25 mg/kg, ip) sul transito intestinale.
Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 8-10 animali, *P<0.05 vs
controllo. 62
0
10
20
30
40
50
controllo
PEA + PMFS
*
*
**
**
2.5 5 10 20
PEA
30 mg/kg
**
**
Transito (%)
Figura 22. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA, 10 mg/kg, ip)
somministrata da sola o in presenza di un inibitore specifico
dell’anandamide idrolasi (PMFS 30 mg/kg, ip) sul transito intestinale.
Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 6-8 animali, *P<0.05, *P<0.01
vs controllo.63
0
20
40
60
2.5 5 10 20 30 mg/kg
#
* *
*
*
olio di croton + PMFS + PEA
olio di croton
controllo
****
olio di croton + PEA
Transito (%)
Figura 23. Effetto della palmitoiletanolamide (PEA, 10 mg/kg, ip)
somministrata da sola o in presenza di un inibitore specifico
dell’anandamide idrolasi (PMFS 30 mg/kg, ip) sul transito intestinale
durante un processo infiammatorio. Ogni punto rappresenta la media ±
SEM di 6-8 animali, *P<0.05, *P<0.01 vs controllo. 64
4.7 Livelli dell’ anandamide e della palmitoiletanolamide in pazienti
affetti da colite ulcerosa
In figura 24 e 25 sono riportati i livelli di anandamide e di PEA contenuti
sia nel colon di pazienti di controllo sia in pazienti con colite ulcerosa.
Come si può osservare il contenuto di anandamide e di PEA è
sensibilmente e significativamente aumentato nel colon proveniente da
pazienti affetti di colite ulcerosa. 65
0.0
0.5
1.0
controllo colite ulcerosa
**
Livelli di Anandamide
(pmol/mg)
Figura 24. Livelli di anandamide nel colon sia di pazienti di controllo che
affetti da colite ulcerosa. Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 6-8
pazienti, *P<0.05 vs controllo. 66
0
1
2
3
4
5
controllo colite ulcerosa
*
Livelli di PEA
(pmol/mg)
Figura 25. Livelli di palmitoiletanolamide (PEA) nel colon sia di pazienti
di controllo che affetti da colite ulcerosa. Ogni punto rappresenta la media
± SEM di 6-8 pazienti, *P<0.05 vs controllo.
67
5.0 DISCUSSIONE
Effetto degli agosti dei cannabinoidi sulla diarrea indotta da tossina
colerica
Studi precedenti hanno mostrato che l’attivazione dei recettori CB1
provoca una riduzione della motilità esofagea (Lehman e coll., 2002) e
gastrointestinale (Izzo e coll., 2001a; Pertwee, 2001; Pinto e coll., 2002a)
sia nel tessuto umano (Croci e coll., 1998; Manara e coll., 2002) che in un
modello sperimentale di diarrea nel topo (Izzo e coll., 2000b). Nei nostri
esperimenti abbiamo dimostrato che l’agonista non selettivo CP55,940 e
l’agonista selettivo dei recettori CB1, ACEA, riducevano la secrezione
intestinale stimolata da CT nell’intestino tenue di topo.
L’effetto antidiarroico degli agonisti dei cannabinoidi è probabilmente
mediato dai recettori CB1 in quanto: 1) l’effetto del CP55,940 e dell’ACEA
era annullato dall’SR141716A, un antagonista dei recettori CB1; 2)
l’SR144528 un antagonista dei recettori CB2, non modificava l’effetto
antisecretorio del CP55,940; 3) l’ACEA, un agonista selettivo dei recettori
CB1, riduceva la secrezione intestinale stimolata dalla CT; 4) il JWH-015
un agonista dei recettori CB2, risultava inattivo.
L’effetto antisecretorio degli agonisti dei cannabinoidi, somministrati per
via sistemica (intraperitoneale), coinvolge probabilmente meccanismi
periferici in quanto l’effetto del CP55,940 e dell’ACEA non era modificato
dal bloccante gangliare clorisondamina. 68
I nostri risultati in vivo, confermano gli studi di Tyler e collaboratori (2000)
che avevano dimostrato che l’agonista dei recettori dei cannabinoidi WIN
55,212-2 inibiva (mediante l’attivazione di recettori CB1) la secrezione
intestinale in vitro.
Un altro dato importante emerso dal nostro studio è rappresentato dal fatto
che la secrezione indotta dalla CT era associata ad un significativo
incremento dei livelli di anandamide (ma non di 2-AG e PEA)
nell’intestino tenue di topi trattati rispetto ai controlli. Non si osservavano
però significative differenze tra i topi di controllo e quelli trattati con CT
nell’attività dell’anandamide amidoidrolasi, l’enzima responsabile della
degradazione fisiologica dell’anandamide, la cui presenza nell’intestino di
topo (Izzo e coll., 2001a; Mascolo e coll., 2002; Pinto e coll.,2002b) e di
ratto (Katayama e coll., 1997) è stata già precedentemente dimostrata.
Questi risultati suggeriscono che l’incremento dei livelli di anandamide
riscontrati nell’intestino dei topi trattati con CT non era causato da una
riduzione della sua degradazione metabolica.
La CT esplica la sua azione secretoria attraverso l’attivazione di riflessi
nervosi secretori nel sistema nervoso enterico che coinvolgono i neuroni
colinergici enterici (Lundgren e Jodal, 1997). Numerosi studi di
immunoistochimica hanno evidenziato la presenza dei recettori CB1 sui
neuroni enterici di varie specie animali, incluso topi, ratti, cavie e maiali
(Kulkarni-Narla e Brown 2000; van Sickle e coll., 2001; Kulkarni-Narla e 69
Brown, 2001; Adami e coll., 2002; Coutts e coll., 2002; Mascolo e coll.,
2002; Pinto e coll., 2002b). In questo studio i recettori CB1 sono stati
localizzati sui neuroni enterici e sulle fibre nervose che risultavano
immunoreattive anche alla ChAT (un marker colinergico); questi dati sono
in accordo con esperimenti funzionali che hanno evidenziato la capacità
degli agonisti dei recettori dei cannabinoidi di ridurre (attraverso
l’attivazione dei recettori CB1) il rilascio di acetilcolina dai neuroni enterici
(Coutts e Pertwee, 1997).
Ulteriori esperimenti hanno mostrato che l’ipersecrezione intestinale
indotta da CT è caratterizzata da un aumento dell’espressione dell’mRNA
per i recettori CB1. Questi dati, insieme all’incremento dei livelli di
anandamide nell’intestino tenue di animali trattati con CT, suggeriscono
che l’attività degli endocannabinoidi, mediata dai recettori CB1, è
aumentata, verosimilmente, per contrastare l’ipersecrezione intestinale
indotta da CT.
Allo scopo di confermare tale ipotesi, sono stati eseguiti una serie di
esperimenti funzionali sulla secrezione intestinale valutando l’effetto degli
antagonisti dei recettori dei cannabinoidi. I nostri risultati hanno mostrato
un aumento della secrezione intestinale in seguito alla somministrazione
dell’SR141716A, un antagonista dei recettori CB1, nei topi trattati con CT
ma non nei topi di controllo. 70
Esperimenti condotti con un’altra specie (ratto) e con differenti dosi e
tempi di somministrazione hanno evidenziato che l’SR141716A
determinava un accumulo basale di fluido intraluminale (Izzo e coll.,
1999b).
Precedenti osservazioni hanno suggerito che l’anandamide attiva i recettori
VR1 dei vanilloidi (Zygmund e coll., 1999) e che recettori VR1
immunoreattivi sono presenti nell’intestino dei roditori (Anavi-Goffer e
coll., 2002). Tuttavia è improbabile che l’anandamide endogena o un altro
endovanilloide eserciti il suo effetto antisecretorio attraverso tale recettore
in quanto la capsazepina, un antagonista dei recettori VR1 (fino a dosi di
30 mg/kg), non modificava la secrezione intestinale indotta dalla CT. Altri
ricercatori hanno recentemente riportato che la somministrazione
intraluminale di anandamide causa un’infiammazione simile a quella
causata dalla tossina A del Clostridium difficile nell’ileo di ratto e che
quest’effetto è significativamente inibito dalla capsazepina. (McVey e coll.,
2003).
Infine abbiamo dimostrato come una modulazione farmacologica dei livelli
di anandamide con un inibitore della sua inattivazione possa ridurre
l’effetto sulla secrezione intestinale della CT.
Infatti, studi condotti utilizzando il composto VDM11 hanno mostrato
un’inibizione della secrezione intestinale indotta da CT fornendo
un’ulteriore evidenza sul ruolo funzionale del trasporto dell’anandamide e 71
sul ruolo protettivo (antisecretorio) dell’anandamide endogena nella
patologia indotta da CT. Inoltre poichè l’effetto del VDM11 era
antagonizzato da una dose sub-massimale di SR141716A si può ipotizzare
un aumento dei livelli degli endocannabinoidi e quindi un’indiretta
attivazione dei recettori CB1.
Effetto degli agonisti dei cannabinoidi sulla motilita intestinale in
condizioni patologiche
L’effetto degli agonisti dei cannabinoidi è stato poi approfondito in
un modello di infiammazione cronica indotta da olio di croton. In questo
modello sperimentale sono stati valutati l’espressione dei recettori CB1, i
livelli intestinali di endocannabinoidi e l’attività dell’enzima anandamide
idrolasi.
Durante il processo infiammatorio non sono state osservate variazioni nei
livelli di endocannabinoidi mentre risultavano aumentati i livelli
dell’enzima anandamide idrolasi. Tali risultati indicano, pertanto, un
probabile aumento del turnover (sintesi e degradazione) degli
endocannabinoidi durante un processo infiammatorio intestinale
Inoltre è stato da noi dimostrato che questo modello intestinale di
infiammazione era associato ad un aumento dei recettori intestinali CB1
(analisi effettuata mediante Western Blot). In accordo con questi risultati
gli agonisti dei recettori dei cannabinoidi riducevano la motilità intestinale 72
a dosi minori di quelle che occorrevano per produrre un uguale effetto in
animali di controllo.
Dati ottenuti con il bloccante gangliare esametonio e con il composto
SR141716A, hanno altresì confermato che l’effetto inibitorio sul transito
gastrointestinale coinvolgeva i recettori CB1 periferici.
Questi risultati appaiono interessanti alla luce di un possibile utilizzo
clinico dei cannabinoidi nei disordini della motilità intestinale associati a
patologie croniche intestinali, quali per esempio il morbo di Crohn.
Effetto della PEA sulla motilità intestinale in condizioni
fisiopatologiche
L’anandamide, come altri agonisti cannabinoidei, naturali e sintetici,
attivando i recettori CB1 a livello enterico, è in grado di ridurre la motilità
intestinale sia in vitro (Pertwee e coll., 1995; Izzo e coll., 1998a) che in
vivo (Fride, 1995; Calignano e coll., 1997; Izzo e coll., 2001b). Nel
presente studio abbiamo dimostrato che l’antagonista selettivo del recettore
CB1, il composto SR141716A, non modificava quello della PEA e questo
sia negli esperimenti in cui erano utilizzati animali di controllo sia in quelli
in cui erano utilizzati animali ai quali era stata indotta una flogosi
intestinale. In letteratura è riportato che alcuni effetti della PEA possono
essere antagonizzati da un antagonista selettivo del recettore CB2, il
composto SR144528 (Facci e coll., 1995; Calignano e coll., 1998). Al 73
contrario dei risultati ottenuti da questi Autori nei nostri studi non si sono
mai osservati gli stessi risultati. Questo fatto non ci sorprende in quanto i
substrati biologici utilizzati sono diversi tra loro.
I risultati dei nostri studi indicano quindi che l’effetto della PEA sulla
motilità intestinale, in condizioni fisiopatologiche, non è mediato né
dall’attivazione dei recettori dei cannabinoidi (così come dimostrato dai
risultati ottenuti in animali pretrattati con i composti SR141716A ed
SR144528) né dall’attivazione di altri sistemi recettoriali come per
esempio quello degli oppiodi, alfa-adrenergico, colinergico gangliare e
quello enzimatico della monossido d’azoto sintasi (così come dimostrato
dai risultati ottenuti in animali pretrattati con naloxone, ioimbina,
esametonio ed L-NAME). Altri studi hanno mostrato che la PEA inibiva
la produzione di NO nei macrofagi del topo e che questo effetto non
sembrava essere mediato dai recettori dei cannabinoidi (Ross e coll.,
2000).
Il PMSF è un inibitore aspecifico dell’anandamide idrolasi. Ricerche
precedenti hanno mostrato che il PMSF aumenta l’attività dell’anandamide
(Wiley e coll., 2000; Lambert & Di Marzo, 1999), e quindi la sua capacità
di ridurre la motilità intestinale (Pertwee e coll., 1995). Nei nostri studi, il
PMSF utilizzato a dosi in grado di potenziare l’attività dell’anandamide
(Wiley e coll., 2000), non modificava l’effetto inibitorio della PEA sulla
motilità intestinale. 74
L’inefficacia del PMSF non ci sorprende visto che la PEA non viene
idrolizzata dall’anandamide idrolasi così come avviene invece per
l’anandamide (Lambert & Di Marzo, 1999), ma da un tipo diverso di
amidasi insensibile al PMSF (Ueda e coll., 1999).
Determinazione dei livelli di anandamide e di PEA in paziente affetti
da colite ulcerosa
I mastociti che sono coinvolti nella colite ulcerosa (Winterkamp e coll.,
2002; Kim e coll., 2003), producono un elevato aumento dei livelli di PEA
(Bisogno e coll., 1997) che inibisce la motilità intestinale, come descritto
precedentemente ciò suggerisce suggerendo che questo mediatore svolge
una azione protettiva nelle infiammazioni del tratto gastrointestinale.
Il blocco dei recettori dei vanilloidi TRPV1 localizzati sui neuroni enterici
(Ward e coll., 2003; Coutts, 2004), uno dei target molecolari della PEA, è
stato proposto come possibile strategia terapeutica per trattare le
infiammazioni del tratto gastrointestinale (Kihara e coll., 2003; Geppetti e
Trevisani, 2004).
I recettori CB1 sono presenti sia sui neuroni colinergici autonomi che su
quelli sensoriali e sono ampiamente co-localizzati con quelli dei recettori
TRPV1 (Kulkarni-Narla e Brown, 2001; Coutts, 2004) ed anche sulle
cellule epiteliali e della mucosa (Ligresti e coll., 2003). Infine gli elevati
livelli di PEA nei pazienti con colite ulcerosa, confermano l’ipotesi che la 75
PEA sia coinvolta nel controllo della motilità intestinale durante condizioni
neuroinfiammatorie; inoltre abbiamo osservato che gli elevati livelli di
anandamide erano significativamene elevati, facendo ipotizzare che
l’azione della PEA in queste condizioni è potenziata dall’azione
dell’anandamide sui recettori CB1 e TRPV1, come suggerito
precedentemente studi condotti in vitro (Di Marzo e coll., 2001; De
Petrocellis e coll., 2001). 76
6.0 CONCLUSIONI
Le conoscenze aneddotiche degli effetti terapeutici attribuiti
tradizionalmente alla canape possono essere oggi verificate alla luce delle
conoscenze sui meccanismi biologici coinvolti nell’azione dei
cannabinoidi. Le attuali evidenze sostengono l’ipotesi che il sistema
cannabinoide endogeno possa costituire la chiave per interpretare nuove
applicazioni terapeutiche anche in alcune patologie dell’apparato digerente.
I nostri risultati supportano l’ipotesi che l’endocannabinoide anandamide
eserciti un ruolo protettivo sull’accumulo di fluido indotto dalla CT
mediante attivazione dei recettori CB1 dei cannabinoidi iper espressi sui
neuroni colinergici enterici, inoltre gli agonisti dei cannabionoidi riducono
la motilità intestinale durante un flogosi mediante l’attivazione dei recettori
CB1 dei cannabinoidi mentre l’effetto inibente della PEA non è dovuto
all’attivazione di essi. Inoltre gli elevati livelli di PEA nei pazienti con
colite ulcerosa ci fanno intendere che la PEA endogena svolge un ruolo
protettivo in tale patologia. Dal punto di vista clinico questi risultati
indicano che due possibili strategie potrebbero essere seguite per ottenere
nuovi farmaci cannabinoidici capaci di bloccare la diarrea e l’ipermotilità
intestinale in condizioni patologiche e privi dei caratteristici effetti
collaterali psicotropici (euforia, alterazione della percezione spaziotemporale
ecc.) e cardiovascolari (ipotensione). La prima è quella di
disporre di agonisti selettivi dei recettori CB1 sul modello dell’agonista 77
oppioide loperamide, che abbiano la minima capacità di attraversare la
barriera emato-encefalica ed agire quindi sui recettori CB1 dei cannabinoidi
localizzati a livello enterico; la seconda strategia sarà quella di usare
inibitori dell’inattivazione degli endocannabinoidi [in maniera simile
all’inibitore dell’encefalinasi acetorfano (Guandalini, 2002)] che mediante
un incremento locale dei livelli di anandamide (patologico) possono avere
un’elevata selettività farmacologica allo stesso modo dei farmaci che
agiscono direttamente sui recettori CB1 dei cannabinoidi.78
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